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<行业新闻> Nat Chem Biol ∣ Scripps研究所发表蛋白聚糖结构的化学编辑

(文章来源于 药学前沿进展)


2022年05月12日,全球顶尖的生物医学研究机构Scripps研究所报道蛋白聚糖结构的化学编辑。

01 背景介绍

哺乳动物细胞的膜蛋白70%是糖蛋白,在生命过程中发挥着重要的作用,例如细胞分化、信号转导、细胞识别、细胞黏附、病毒感染入侵、免疫调节,肿瘤逃逸等。举个例子,例如蛋白聚糖能促进FGF2(成纤维细胞生长因子)与其受体FGFR的结合,激活细胞分化的信号通路。细胞表面高度O糖基化的粘蛋白(mucin)是流感病毒(influenza A)感染细胞的受体。

02 蛋白聚糖的结构

蛋白聚糖(proteoglycan, PG)由核心蛋白和聚糖组成,聚糖的起始端木糖(Xylose)与蛋白上的丝氨酸相连,且聚糖均有一个共同的四糖linker(Xyl-Gal-Gal-GlcA),随后是不同的二糖重复单元。由IdoA-GlcNAc二糖重复单元构成硫酸乙酰肝素(HS, heparansulphate),由GlcA-GalNAc二糖重复单元构成硫酸软骨素(CS, chondroitin sulphate)。

二糖重复单元上,还会存在不同程度的硫酸化修饰,硫酸化修饰越多,蛋白聚糖的电负性越强,理论上与富含正电氨基酸蛋白质的相互作用力就更强。

细胞膜上的蛋白聚糖有两种形式,GPI锚定的磷脂酰肌醇蛋白聚糖Glypican(核心蛋白60-70kD),及Syndecan(核心蛋白20-45kD),其核心蛋白为I型跨膜蛋白,本文作者选择了结构简单的Syndecan作为切入点。

03 本文设计的精华部分

科学问题:蛋白聚糖存在于所有动物细胞膜及胞外基质中,能与多种生长因子、趋化因子、酶等相互作用,影响多种信号通路。但是具体的细节例如蛋白聚糖的哪种成分,聚糖与蛋白质哪个更重要,聚糖的多价结合效应是否有影响并不清楚。

本文作者,巧妙地利用遗传密码子扩展技术实现对蛋白聚糖结构的化学编辑,为蛋白聚糖结构与功能关系研究提供了一种通用的新方法。

1、核心蛋白定点引入非天然氨基酸

利用遗传密码子扩展技术在核心蛋白的糖基化位点引入非天然氨基酸pPY(p-propargyl-tyrosine,炔丙基酪氨酸)(产量在0.3-4mg/L),引入的炔基把手可以实现聚糖的定点修饰。

2、叠氮糖胺聚糖(azGAG)的生物合成

聚糖的四糖linker是在内质网里合成的,二糖重复单元是在高尔基体里合成的,作者巧妙地利用木糖-叠氮苯为起始糖(种子),利用CHO细胞的GAG(糖胺聚糖)生物合成途径,获得叠氮糖胺聚糖(azGAG)。

首先,作者合成了木糖-叠氮苯(化合物2)作为GAG合成的“种子”。

然后,用第一个“延伸酶”(β4GalT7)半乳糖基转移酶的晶体结构与化合物2进行分子对接,结果显示,酶的底物结合口袋能够容纳木糖-叠氮苯,从理论上证明木糖-叠氮苯作为合成GAG“种子”的可能性。

接着,将木糖-叠氮苯投入到CHO-S细胞中,培养72h,收集培养基上清,用WAX(弱阳离子交换)纯化获得带叠氮的重组GAG(混合物)。

最后,用CSase酶处理GAG(酶解CS),获得相对纯的HS(硫酸乙酰肝素),用HSase酶处理GAG(酶解HS),获得相对纯的CS(硫酸软骨素)。

04 叠氮糖胺聚糖的表征(azGAG)

作者通过实验证明了,叠氮糖胺聚糖(rGAG)是分泌到培养基上清中的,并通过二糖分析鉴定了azHS(叠氮硫酸乙酰肝素)占比27%,与天然GAG的占比相似。

然后分析了HS的硫酸化程度(图H为不同硫酸化HS的标准曲线),证明了azHS(叠氮硫酸乙酰肝素)与天然的硫酸乙酰肝素具有相似的硫酸化修饰程度(硫酸化修饰程度越高,聚糖的电负性越强,理论上与富含正电氨基酸的蛋白质结合能力越强)。

结论:综上,作者拿到的azHS(叠氮硫酸乙酰肝素)能够代表天然的HS(硫酸乙酰肝素),可用于功能研究。

05 蛋白聚糖结构与功能关系的研究

1、GAG成分及多价效应对结合力的影响

作者通过AlphaScreen技术评估GAG与靶蛋白的结合力。

AlphaScreen技术的原理:蛋白聚糖的核心蛋白SDC通过C端His tag与磁珠结合,将待检测的蛋白生物素化标记(如FGF2,FGFR1,VN),通过链霉亲和素信号检测半数有效浓度(EC50),EC50越小,结合力越强。

不同GAG对结合力的影响:与核心蛋白连接HS相比,连接HEP后与FGF2的亲和力提高了一个数量级。不同的GAG,产生的结合效果不一样。

GAG数量对结合力的影响:对于FGF2蛋白来说,核心蛋白连接2个HS的结合力强于连接3个HS,对于VN蛋白来说,核心蛋白连接2个或3个HS的结合力相近。对不同的蛋白来说,GAG的数量对结合力的影响不一样。

HS:硫酸乙酰肝素;HEP:肝素(硫酸化程度更高,电负性更强)

2、蛋白聚糖对干细胞分化的影响

作者首先构建了一个基因敲除的干细胞系mESC(EXT1-/-),将负责GAG合成的关键酶EXT1敲除后,mESC(EXT1-/-)无法分化。

通过人工回补蛋白聚糖后,又恢复了分化能力。通过RT-qPCR检测干细胞标志基因Nanog及分化后的标志基因SOX1/TubB3的表达水平,以及荧光共聚焦实验,证明了GAG能促进干细胞分化。

将蛋白聚糖插入到细胞膜的方法:首先合成一个双亲性的分子cholPEGNTA(cholesterol-PEG2000-NTA),一端是含胆固醇的亲脂性基团,可以插入到细胞膜上,通过PEG2000连接NTA(氨基三乙酸),进一步螯合镍离子,蛋白聚糖的C端含有His tag可以和细胞膜上的镍结合,这样就将蛋白聚糖插入到了细胞膜上。

3、蛋白聚糖对肿瘤细胞黏附及伸展的影响

细胞黏附与蛋白聚糖密切相关,作者将乳腺癌细胞系MDA-MB-231的SDC1敲低后,肿瘤细胞系无法合成相应的蛋白聚糖,黏附和伸展的能力大大降低,再通过人工回补蛋白聚糖,又恢复了肿瘤细胞系的黏附及伸展能力,证明了GAG对细胞黏附及伸展的重要作用。

4、利用APEX2在活细胞中实现邻近标记

将抗坏血酸过氧化物酶(APEX2 peroxidase)融合在蛋白聚糖核心蛋白SDC的N端,在1mM H2O2和生物素酚(APEX2的底物)存在下(处理1min),催化形成短寿命(<1ms)的生物素自由基,可对邻近(<20nm)蛋白进行生物素化标记。接着通过链霉亲和素分离结合质谱技术,可以进行蛋白组学研究。

作者成功的利用SDC-APEX2在活细胞中实现对与GAG相互作用的蛋白生物素化标记。

06 总结

本文最大的亮点是利用遗传密码子扩展技术实现对蛋白聚糖结构的化学编辑,为蛋白聚糖结构与功能研究提供了新的方法。

先在核心蛋白上引入非天然氨基酸,又利用木糖-叠氮苯(种子)劫持细胞的糖胺聚糖生物合成途径获得重组叠氮糖胺聚糖(azGAG),实现了蛋白聚糖的定点化学修饰。通过该方法,可获得连接不同聚糖、不同聚糖数量的纯的蛋白聚糖,然后将人工合成的纯的蛋白聚糖回补到细胞膜上,这是一种研究聚糖结构与功能的通用方法。


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