<行业新闻> 抗体糖基化与工程改造

（来源于闲谈 Immunology ，作者挑食的喵）

1、抗体糖基化

IgG活性取决于IgG亚型和Fc段糖基化。

• 四个人类IgG：IgG1-4，IgG1和IgG3与I型FcγRs具有高的亲和力。

• Fc段CH2结构域的Asp297 N-连接寡糖复合物，对于Fc结构极为重要。糖基化调节Fc构象的稳定程度，进而影响Fc和1型及2型FcγR的结合。

      核心7糖结构：四个N-乙酰葡糖胺和三个甘露糖残基。

      核心Fc糖基化改造

• 核心岩藻糖基化；

• 双切乙酰葡萄糖胺化；

• 单臂或两臂的半乳糖化；

• 半乳糖的存在下添加末端唾液酸。

除了在Fc区中保守的N-糖基化位点之外，mAb在可变域中具有N-糖基化的共有序列（NXS/T，X不能为P）。可变结构域糖基化对抗原结合有影响，但对体内半衰期没有影响。Fab糖基化的末端半乳糖的较高水平，增加了通过α1，3-半乳糖和唾液酸化进一步半乳糖基化的可能性。与Fab相关的低聚糖加上α1,3-半乳糖（Gal）已显示出免疫原性。唾液酸化也可以增加N-羟乙酰神经氨酸（NGNA）的免疫原性部分。α-1,3Gal和NGNA的添加高度依赖于细胞系，应使用预期的稳定细胞系评估其水平。

2、FcγR分型、分布、信号通路

根据和特定糖修饰的Fc段结合能力差异，将FcγR分为1型和2型。

1型FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb)为免疫球蛋白超家族，与唾液酸化Fc段IgG结合弱。抗体通过Fc段结合FcγR，是抗体（抗体药物）发挥其抗感染及抗肿瘤功能所必需的。

2型FcγR（DC-SIGN/CD209， CD23/FcεRII),他们都是c型凝集素受体，在免疫复合物中结合唾液酸化的Fc段。DC-SIGN/CD209介导抗炎症信号，CD23介导生发中心B细胞选择。

3、抗体Fc改造增强ADCC

IgG1和IgG3可以诱导强的ADCC效应，但是IgG1比IgG3有更长的半衰期和更稳定的结构，所以ADCC效应抗体通常选择IgG1亚型。

要发挥ADCC效应，抗体需要和Fc受体（FcγR）结合。抗体通常通过铰链区及CH2区域和FcγR结合。CH2结构域的Asn-N297链接糖基化修饰，及修饰的糖型成分（如乙酰葡糖胺，甘露糖，岩藻糖和唾液酸等）决定CH2结构的稳定性及结合特性。因而ADCC效应抗体，Fc段糖修饰是主要的工程工艺。

工艺1：Fc糖基化改造

        IgG和FcγR的结合一般是低亲和力的，为了增强ADCC的功能，需要增加二者结合的亲和力。从FcγR在免疫细胞分布来看，NK细胞作为ADCC的主要效应细胞，主要表达FcγRIIIa。

增强ADCC糖基化工程策略是增加和FcγRIIIa的结合，方法是去除核心的岩藻糖，增加IgG1 Fc与 FcγRIIIa Asn162结合。当然去除Fucose也有一些问题，比如减少了FcγRIIIa可结合的IgG Fc构象多样性，抑制了糖和糖的直接结合。但是去除核心岩藻糖是增强ADCC普遍使用的策略。

小范围内，半乳糖苷化可以调节Fc和FcγRIIIa的结合，但是在没有去除岩藻糖的情况下，结果变异比较大，从完全没有增强效应到有很好的增强效应，原因是半乳糖与FcγRIIIa不同N糖结合。Fc段的唾液酸化对ADCC的影响是最小的。

方法2：定点突变

        高分辨率结构分析，可以解析IgG Fc和FcγR结合的氨基酸位点，可以有针对性的进行点突变，现在发现的主要位点有，下铰链的Leu234–Ser239和CH2结构域的Asp265–Glu269,   Asn297–Thr299。所以在这些区域，或者临近区域的突变，提高亲和力。目前S298A/E333A/K334A 和S239D/I332E已经被证实可以增强ADCC。P247I/A339Q被用于第三代CD20抗体ocaratuzumab，被证实有很好的效果。

        结构分析显示，Fc和FcγR结合是不对称的，Fc段突变造成的不对称性，可以最大程度增加和FcγR的亲和力。Fc突变形成的异二聚体，可以提高CH2结构的稳定性，以及和FcγR的亲和力。

工艺3：Fc段多聚体

        和糖型改造，点突变相比，增加IgG1的Fc段数量（一个抗体带多个Fc段）显得更加的直接。一个IgG1带有多个Fc段，结合多个FcγRIIIa,增强ADCC作用。简评：糖基化是抗体药物关键质量属性，需要系统表征。