<行业新闻> 聊一聊糖生物学来源于微信公众号@枫林糖话，作者：一颗草莓 聚糖修饰着人体中的每一个细胞和大多数分泌的蛋白质。基因组学、糖蛋白组学和化学生物学工具的发展加深了人们对糖生物学的理解。糖基化是在糖基转移酶作用下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，起始于内质网，结束于高尔基体。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质，帮助蛋白质折叠功能的作用。近年来，多项研究揭示糖基化在免疫逃避和认知性疾病过程中发挥着重要作用。该领域正迎来药物开发的热潮，目前，基于糖生物学已经开发出了多种改善人类健康的药物。本期内容主要聚焦于三个领域—选择素、免疫球蛋白样凝集素和靶向聚糖的抗体，为大家解读聚糖的生物学作用及其在医学中的应用前景。
01 聚糖及其生物学功能 人体中的聚糖主要由十种单糖构成：葡萄糖（Glc），半乳糖（Gal），N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），N-乙酰半乳糖胺（GalNAc），岩藻糖（Fuc），木糖（Xyl），唾液酸（Neu5Ac），葡萄糖醛酸（GlcA），甘露糖（Man）和艾杜糖醛酸（IdoA）。这些单糖组装成聚糖是由与内质网和高尔基体相关的酶类完成的。单糖通过一种糖的异头碳和另一种糖的羟基之间的糖苷键连接在一起。糖苷键相对于异头碳的方向影响糖的整体形状，例如，Galβ1-4Glc，指的是通过β-糖苷键与葡萄糖C4上的羟基连接的半乳糖。单考虑这些因素，葡萄糖和半乳糖在其环状结构中通过糖苷键连接在一起就有20种不同的方式。而糖基的硫酸化、甲基化、磷酸化、乙酰化和o -酰基化修饰使其更加复杂。 糖基化有三种广泛的功能。首先，一些聚糖形成具有独特物理性质的结构。其次，聚糖可以调节其所附实体的功能或性质，例如通过控制蛋白质稳定性或受体二聚化。最后，某些聚糖本身是凝集素的配体，凝集素是碳水化合物特异性受体。 选择素是一个钙依赖性(C型)凝集素家族，其最突出的作用是介导免疫细胞粘附到内皮，促进其进入次级淋巴器官和炎症部位。选择素在介导细胞黏附方面的重要性启发了靶向选择素-配体相互作用的疗法，并且已经在镰状细胞病、癌细胞转移和骨髓移植中进行了研究。 选择素家族由三个成员组成，L-选择素组成性地表达于所有循环白细胞。E -选择素组成性表达于骨髓和皮肤的毛细血管后小静脉内皮细胞，在其他器官的内皮表达需要暴露于炎症刺激，如TNF， IL-1β和 LPS。P -选择素主要由内皮细胞和活化的血小板表达。 选择素识别唾液酸化和岩藻糖基化聚糖，但也能结合硫酸乙酰肝素糖胺聚糖的一个亚群。在正常生理学中，选择素是白细胞通过次级淋巴组织循环和募集到炎症部位的关键介质。通过血管腔室的细胞被选择素-配体相互作用捕获后，开始在内皮细胞上滚动，这是白细胞外渗的最早阶段。在次级淋巴组织，表达L -选择素的白细胞与高内皮微静脉的内皮细胞表达的糖蛋白结合，促进外渗作用。白细胞被募集到炎症部位，该部位的内皮细胞主要表达E -选择素和P -选择素。聚集的免疫细胞本身表达的L -选择素进一步促进白细胞的黏附和募集。因此，选择素或其配体的上调可将白细胞引导到特定的位置。
图1 选择素及其一级配体 小分子选择素抑制剂的开发 小分子选择素抑制剂的开发灵感来源于对P -选择素及其主要配体PSGL1相互作用的研究。首先，研究人员发现PSGL1中的3个磺基酪氨酸是P-选择素的重要结合决定簇。此后不久，P-选择素和E-选择素与sLex和PSGL1复合体的晶体结构被明确。PSGL1中的三种磺基酪氨酸产生阴离子口袋，增加了其对P-选择素的亲和力，这就解释了为什么P-选择素与PSGL1的相互作用明显高于单独与聚糖的亲和力。而PSGL1的聚糖和蛋白质部分可以被认为是不同的药效团。对sLex与E-选择素结合的溶液结构进行的NMR研究强调了与半乳糖和岩藻糖氢键接触的重要性。这一发现被纳入GlycoMimetics的泛选择素抑制剂Rivipansel (GMI-1070)的设计中，该抑制剂保留了类似于sLex聚四糖中的羧基结构，并模拟PSGL1中的磺基酪氨酸添加了硫酸化萘基团。Rivipansel在镰状细胞病小鼠模型中能够抑制E -选择素和P -选择素介导的白细胞滚动，并逆转血管闭塞。在急性镰状变危象患者中开展的一项2期试验(NCT01119833)表明，Rivipansel可缩短血管闭塞消退的时间，并减少阿片类药物的使用。
图2 P-选择素与PSGL1形成复合物 由于部分靶向选择素开发的小分子抑制剂存在脱靶效应、结合力太弱等问题，对此，Texas生物公司一种小分子拟糖拮抗剂，该拮抗剂用联苯单元取代了sLex的N -乙酰乳糖胺(LacNAc)，用羧酸部分取代了唾液酸，并使用甘露糖替代岩藻糖，设计出了Bimosiamose（TBC-1269）这一新型药物，对缺血-再灌注损伤、哮喘、银屑病、慢性阻塞性肺疾病均具有一定治疗作用。 生物选择素抑制剂 有研究表明：使用重组P-选择素配体抑制P-选择素可减少非人灵长类动物模型中的血栓形成。这些发现促使被惠氏收购的遗传学研究所公司开发一种嵌合P-选择素-免疫球蛋白融合蛋白rPSGL-Ig，该蛋白在心肌梗死猪模型中的具有良好的溶栓效果。Y's Therapeutics随后评估了rPSGL-Ig（YSPSL）在改善器官同种异体移植功能方面的用途。Hoffmann-La Roche开发了单克隆抗体inclaclumab作为P-选择素拮抗剂。在一项 II 期试验（NCT01327183）中，inclaclumab 减少了因非 ST 段抬高型心肌梗死而接受经皮冠状动脉介入治疗的患者的心肌损伤。Selexys选择将其P -选择素阻断抗体crizanlizumab (SEG101，也称为SelG1)作为镰状细胞病患者血管阻塞危象的预防性药物。值得注意的是，crizanlizumab单抗降低了疼痛危象的发生频率，并且可以每3 ~ 4周给药1次。诺华公司现已收购Selexys，并于2019年底批准crizanlizumab单抗上市。 选择素在癌症中的研究 1990年代早期的出版物显示了选择素在肿瘤细胞转移中的作用，这引起了人们对在癌症中靶向选择素的兴趣。淋巴组织中L -选择素配体可促进白血病和淋巴瘤的转移；在结肠癌细胞中，能够与E-选择素相互作用的唾液酸Lewis结构与肿瘤转移潜能相关；微血管中血小板和内皮表达的P -选择素可能阻止细胞细胞转移。在一项具有里程碑意义的研究中，发现白血病细胞存在于高表达E-选择素的骨髓微环境区域，此外，多项研究已证实许多实体癌和血癌细胞表达E-选择素配体。这意味着E-选择素-配体相互作用是促进癌细胞转移到骨骼的机制之一，为抑制肿瘤骨髓转移的治疗提供了新思路。 选择素靶向疗法的前景 早期通过抑制选择素治疗心血管疾病努力成效不大，但选择素抑制的对癌症治疗的积极结果重振了该领域。已有的方法包括用P-选择素配体修饰的纳米颗粒进行靶向药物递送，以及通过设计高表达sLex的CAR-T细胞，以增强其E-选择素配体的表达，进而促进对骨髓的浸润。 Siglecs是一类细胞表面受体，大多数Siglecs作为跨膜受体发挥作用，主要以细胞类型特异性方式在血细胞表面表达，通过识别含有唾液酸的糖链结构（如唾液酸化蛋白质、脂质和RNA）介导细胞与细胞或细胞与病原体间的相互作用，因此在固有免疫和适应性免疫中发挥重要的调控作用。由于它们与免疫球蛋白超家族的同源性，Siglecs被认为是I型凝集素。在结构上，它们包括一个氨基末端V-set结构域，该结构域结合唾液酸化聚糖，然后是几个免疫球蛋白样结构域，一个跨膜结构域，最后是一个带有激活或抑制信号基序的羧基末端细胞质尾部。广义上，Siglecs可分为两个家族:保守型Siglecs，包括唾液黏附素(Siglec-1)、CD22 (Siglec-2)、髓鞘相关糖蛋白(MAG;Siglec-4)和Siglec-15;以及CD33相关(CD33r) Siglecs，这些Siglecs在不同物种之间有很大差异。目前临床试验中针对Siglec糖生物学的治疗方法较少。然而，最近大量数据表明Siglecs与癌症、感染性疾病和神经科学相关，这使得该领域成为糖生物学中最具活力和最活跃的领域之一。 Siglecs可作为细胞标记物 唾液黏附素被确定为巨噬细胞与骨髓黏附的主要介质后不久，CD22被鉴定为B细胞标志物和细胞间相互作用的参与者；CD33 (Siglec-3)是髓系细胞标志物；MAG是少突胶质细胞标志物。这些发现提示：Siglecs可以作为细胞标记物。 事实上，Siglecs的表达模式已使靶向特定细胞群的治疗成为可能。例如，抗体-药物偶联物(ADC)吉妥珠单抗奥佐米星（Gemtuzumab Ozogamicin, Mylotarg)是由抗CD33的单克隆抗体偶联到强效DNA损伤剂卡来米星(calicheamicin)组成，FDA已批准其用于治疗AML。其他抗CD33 ADC(如SGN33A和IMGN779)正在研发中。B细胞白血病和淋巴瘤上的CD22是数种ADC的靶点，如奥英妥珠单抗(Inotuzumab Ozogamicin, Besponsa)和匹纳妥珠单抗(Pinatuzumab Vedotin)。针对CD22和CD33的抗体也被用于制备双特异性抗体和CAR T细胞，用于治疗造血系统肿瘤。用唾液黏附素配体修饰的脂质体可选择性地将抗原递送至巨噬细胞，而携带高亲和力CD22配体的纳米颗粒可有效地将多柔比星导向B细胞淋巴瘤细胞。
图3 Siglec靶向治疗的方式 Siglecs介导免疫稳态 由于大多数Siglecs的细胞质尾巴中存在免疫受体酪氨酸的抑制基序（ITIMs），使得Siglecs可以作为调控免疫稳态的重要介质。通常，Siglecs通过将SHP家族磷酸酶募集到其ITIM或ITIM样结构域来抑制免疫细胞活化，进而抑制其他信号通路。少数Siglecs跨膜区的碱性残基与包含衔接蛋白DAP12的免疫受体酪氨酸激活基序偶联，从而启动信号传导。Siglec活性与免疫细胞杀伤、病原体清除和细胞因子产生相关，因此与许多炎症性疾病和表型相关。 作为研究得最好的Siglec，CD22为探究Siglec生物学功能提供了一个有用的模型。CD22与唾液酸化配体结合的发现提示它可能在细胞粘附中起作用。并且CD22也负调节B细胞受体，增加了它抑制B细胞和缓和体液免疫的可能性。事实上，CD22与邻近CD22分子上的α2,6连接的唾液苷相互作用，从而将自身与B细胞受体隔离在同型低聚体中。在该模型中，B细胞与唾液酸化自身抗原的相互作用为CD22提供反式接触，从而分散纳米团簇，并允许CD22与B细胞受体结合并抑制其作用。此外，CD22是一种内吞受体，不断内化并循环到表面。因此，Siglec活性一般由几个参数控制，包括顺式和反式相互作用的可用性，对任何给定配体的相对亲和力和密度，以及内化和再循环的速率，这种复杂性是药物开发的一个障碍。 Siglec靶向疗法的前景 目前，FDA批准的唯一Siglec靶向疗法是针对CD22和CD33的ADC，它们使用Siglec作为肿瘤特异性抗原来鉴定靶细胞。随着我们对Siglec生物学功能的研究的深入，Siglecs在调节正常生理学和疾病炎症方面的重要性可能会越来越得到认可。例如：CD33的缺失有利于维持小胶质细胞稳态，改善5xFAD小鼠模型的病理学特征；用CD22阻断抗体治疗老年小鼠可增强小胶质细胞介导的Aβ和α-突触核蛋白的清除率，并显着改善认知功能；将可溶性CD24与免疫球蛋白Fc结构域的偶联为二聚体的CD24Fc，可以作为Siglec-10 激动剂目前正在III期试验中进行测试，以预防急性移植物抗宿主病（NCT04095858）和与严重COVID-19相关的炎症（NCT04317040）。 聚类是开发调节Siglec活性的疗法时要考虑的关键原则。其中二聚化通常是激动性的，因为靶向含有ITIM结构域的Siglecs的交联抗体会抑制免疫细胞活性。同样，在多价支架(如纳米颗粒、脂质体或聚合物)上的拟糖Siglecs配体可聚集Siglecs并发挥受体激动剂作用。单独的Siglec 的单链可变片段（scFvs）或高亲和力拟糖配体更有可能作为拮抗剂发挥作用。目前该领域最大的需求是建立Siglecs相关配体目录以及糖蛋白组学和糖脂组学工具，提高其检测效率。多个生物公司针对Siglecs的疗法即将进入临床试验，例如：Innate Pharma公司的Siglec中和抗体用于癌症，Medimmune公司的抗Siglec-15抗体用于白血病，Alethia公司的抗Siglec-15抗体用于成骨不全症。 04 肿瘤疫苗 肿瘤疫苗的基本原理是利用免疫系统的来识别和消除携带某些抗原的恶性细胞。将聚糖与免疫原性载体蛋白（如KLH）偶联，以及添加疫苗佐剂（如QS-21），可以实现靶向哺乳动物聚糖，打破自身耐受，促进T细胞反应。 神经节苷脂GM2和GD2是给予全细胞黑色素瘤疫苗作为辅助免疫疗法后患者血清中最常见的抗原之一。使用天然来源的神经节苷脂制备的GM2特异性疫苗单独免疫原性较差，尽管与卡介样芽孢杆菌联合使用刺激了黑色素瘤患者的抗体产生并改善了无病生存率，但其反应持续时间和抗体滴度较低，因此使用KLH替代卡介苗，并添加佐剂QS-21以增加IgG滴度。遗憾的是，在一项 III 期试验中（NCT00005052）改良侯的疫苗在II期黑色素瘤患者中缺乏疗效，推测是因为单价GM2可能无法刺激强烈的免疫反应。聚糖多价可能是最有希望的前进道路。在最近的一项I期试验(NCT01248273)中，由碳水化合物- KLH结合物组成的七价疫苗诱导了中度体液应答，在单一支架上连接在一起的globo H、GM2、Tn、sTn和T抗原(Galβ1-3GalNAc)的聚糖组成的第二代五价疫苗提高了针对这些抗原的IgG滴度。此外，由碳水化合物模拟肽与PADRE（T细胞激动剂）偶联而成的疫苗产生了针对Ley抗原和GD2的抗体，并且在一项1期试验(NCT01390064)显示对乳腺癌患者有潜在益处。 靶向聚糖的抗体 基于抗聚糖抗体的疗法避免了主动免疫疗法面临的许多障碍。首批成功应用于临床的抗聚糖疗法是抗GD2抗体dinutuximab，目前FDA批准其用于治疗高危小儿神经母细胞瘤。数据表明Fuc-GM1抗体可以抑制小鼠的肿瘤植入并促进补体依赖性细胞毒性，促使百时美施贵宝开发出用于小细胞肺癌的全人源抗Fuc-GM1抗体（BMS-986012）。针对globo H的抗体抑制血管生成并促进globo H阳性肿瘤的抗体依赖性细胞毒性，目前在实体瘤患者中对globo H抗体OBI-888开展了一项1 / 2期试验(NCT03573544)，对OBI-999(基于相同抗体的ADC)开展了一项1 / 2期试验(NCT04084366)。 在糖蛋白中，粘蛋白MUC1作为癌症免疫治疗的靶标受到最多关注。MUC1在黏液腺癌中大量表达，并发生异常O -糖基化，具有sTn、Tn和T抗原等短聚糖。用MUC1 Tn - KLH结合物免疫小鼠，获得了一种有效的特异性单克隆抗体5E5。有趣的是，5E5和从这些小鼠分离的其他B细胞克隆识别的MUC1表位映射到相同的串联重复区域，表明存在免疫显性糖肽。5E5抗Tn-MUC1抗体与人乳腺癌系结合，诱导抗体依赖性细胞毒性。 糖生物学是自然科学中一个快速发展的领域，与基础研究、生物医学和生物技术的许多领域具有广泛的相关性。随着聚糖检测技术的不断进步，我们对聚糖的功能有了不断深入的了解。它们是蛋白质功能的重要调节剂和 疾病的驱动因素，聚糖结合蛋白的配体发现，靶向聚糖结合蛋白的生物制剂开发也具有无限前景。 |
