<行业新闻>抗体加速稳定性实验中的N-glycan降解

来源于微信公众号@质控实验室

问题描述

最近遇到了某个项目的样品在做稳定性实验的时候，发现有N-glycan显著降解的问题。从完整分子量水平即可以看得很清楚：随着时间的延长，降解的比例越来越高，而且主要是乙酰葡糖胺逐个的被降解下来。

文献调研

针对这一问题，进行了相关文献的调研。结果，还真找到了一篇Merck的研究人员发表在Biotechnology   Progress上的相关文献。他们发现在做稳定性实验的时候四个抗体中的一个有N-glycan降解的问题，并发现这种降解来源于宿主细胞蛋白残留中的一种己糖胺苷酶B（hexosaminidase B）。

文章解析

Merck的研究人员在对mAb1,2,3,4四种抗体进行储存和加速稳定性试验分析的时候，发现mAb1的糖型在40c稳定性样品中显著发生变化（图1）。G0F和G1F两种糖在40℃放置6个月之后，比例显著降低，而掉一个GlcNAc的比例明显增加。

图1

他们推测可能是HCP中含有的某种酶引起的糖型的降解。虽然在用ELISA方法表征HCP残留的时候，mAb1的HCP低于30ppm，满足＜100ppm的限制。为了验证这一推测，研究人员对mAb1进行了基于LC-MS的蛋白质组学分析，检索到了一种糖苷酶——hexosaminidase B，匹配到24条特异性肽段，覆盖度达到了47%。此外，通过MRM定量的方法，对mAb1中该蛋白的含量进行了测定，约为658ppm，明显超过了限制标准。而对其他三种抗体分析，并未发现有己糖胺苷酶B 检出（表1）。

表1

己糖胺苷酶B在其他的物种中名字为N-乙酰葡糖胺糖苷酶。为了确证这种酶及其酶活，研究人员以mAb1样品中残留的己糖胺苷酶B作为酶， 4-硝基苯基 N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖作为底物进行酶促反应，发现水解底物活性与mAb1的浓度有显著相关性（图2）。

图2

糖型降解的问题解决了，怎么去除这种酶呢？他们还进行了纯化工艺上的优化，最终产品中己糖胺苷酶B的残留量降到了16ppm。