来源于微信公众号 Cell Culture
在生物制药领域，蛋白药物的疗效与稳定性始终是研发核心。而 O 糖基化作为一种关键的翻译后修饰，正逐渐揭开其调控蛋白药物功能的神秘面纱 —— 它不仅影响蛋白的溶解度、稳定性，更直接关联药物的血清半衰期、免疫原性与靶向活性。今天，我们结合一篇发表于《Bioscience Reports》的综述，带大家系统梳理 O 糖基化的作用机制、在经典治疗蛋白中的功能，以及前沿糖工程技术的应用。
一、O 糖基化的核心机制：从合成到结构多样性
1. 合成路径：与 N 糖基化的关键差异
O 糖基化与我们熟知的 N 糖基化在合成逻辑上截然不同：
- 发生位置：主要在高尔基体中进行，且需在蛋白折叠完成后启动
- 合成方式：以单糖为单位逐步添加，而非 N 糖基化的 "整体转移" 模式
- 起始信号：无严格的氨基酸序列基序（如 N 糖基化的 NXT/S），但常以 Ser/Thr 残基为受体，且 + 3 位脯氨酸（Pro）是常见邻近特征
- 核心酶类：由 20 种 GalNAc 转移酶（GalNAc-Ts）家族成员启动，不同亚型具有组织特异性表达特征
2. 核心结构：四大主要类型与修饰延伸
黏蛋白型O 糖基化以 N - 乙酰半乳糖胺（GalNAc）为起始糖，可延伸形成 4 种主要核心结构（图 1），其中核心 1 和核心 2 在非黏蛋白类治疗蛋白中最为常见：
- 核心 1（T 抗原）：由 T 合成酶（C1β3GalT）催化添加半乳糖（Gal）形成，需分子伴侣 COSMC 协助折叠激活
- 核心 2：在核心 1 基础上由 C2GnT 合成酶添加 N - 乙酰葡糖胺（GlcNAc）形成
- 核心 3/4：主要存在于黏蛋白中，核心 3 由 C3GnT6 催化合成，核心 4 由核心 3 进一步延伸而来
- 修饰延伸：各核心结构可通过添加唾液酸（Neu5Ac）等形成唾液酸化衍生物（如唾液酸 - Tn 抗原、二唾液酸核心 1），直接影响蛋白的理化性质
图 1 黏蛋白型 O - 聚糖核心结构及关键唾液酸化糖型
二、O 糖基化在治疗蛋白中的核心功能：实例解析
综述通过 10 余种经典治疗蛋白的研究数据，揭示了 O 糖基化的三大核心功能，以下为关键案例：
1. 调控生物活性：精准介导蛋白 - 蛋白相互作用
- 凝血因子 X（FX）：T17 和 T29 位的二唾液酸核心 1 O 糖基化，是其与激活蛋白酶 FVIIIa/FIXa 特异性结合的必需条件，缺失后 FX 激活效率显著降低
- 肿瘤坏死因子 α（TNFα）：GalNAc-T2 介导的 O 糖基化可调控 ADAM17 蛋白酶对其胞外域的切割释放，为自身免疫病治疗提供靶点
2. 提升稳定性与半衰期：延长药物体内作用时间
- 促红细胞生成素（EPO）：T126 位的二唾液酸核心 1 O 糖基化与 N 糖基化协同作用，减少肝脏清除，延长血清半衰期
- 依那西普（Etanercept）：连接区的唾液酸化核心 1、唾液酸 - Tn 等 O 糖型，通过掩盖半乳糖残基避免巨噬细胞清除，同时增强 TNFα 结合亲和力
3. 降低免疫原性：减少药物不良反应
- 白细胞介素 2（IL-2）：T3 位的唾液酸化核心 1 O 糖基化可抑制蛋白聚集，而聚集态 IL-2 是诱导机体产生抗体的主要原因
- 粒细胞集落刺激因子（G-CSF）：T136 位的单 / 二唾液酸核心 1 可稳定蛋白构象，避免因解折叠形成无活性聚合物，降低免疫原性
三、前沿糖工程技术：定制化优化治疗蛋白
针对 O 糖基化的功能特性，综述重点介绍了三大类糖工程策略，为蛋白药物改造提供新思路：
1. 融合蛋白技术：引入功能性 O 糖基化位点
- CTP 融合策略：将绒毛膜促性腺激素 β 亚基的 C 端肽（CTP）与治疗蛋白融合，CTP 携带的唾液酸核心 1 O 糖基化可显著延长半衰期。如生长激素融合体 Somatrogon，实现每周 1 次给药（传统剂型需每日给药）
- Fc 融合技术：依那西普、阿巴西普等融合蛋白的铰链区可产生新的 O 糖基化位点，兼顾半衰期延长与靶点结合活性
2. 细菌表达系统改造：低成本生产人源化 O 糖蛋白
通过在大肠杆菌中异源表达：
- 哺乳动物糖基转移酶（如 GalNAc-T2、ST6GalNAc1）
- 细菌来源的核心 1 合成酶（如空肠弯曲杆菌 CgtB）成功实现二唾液酸核心 1 等人类 O 糖型的高效合成，为低成本生物类似药研发提供可能
3. 位点特异性糖修饰：精准调控蛋白功能
- 基于 ISOGlyP 预测工具：通过定点突变优化 GalNAc-Ts 底物识别序列，提高目标位点的 O 糖基化效率
- 化学半合成技术：制备均一 O 糖型的 IL-2 变体，发现唾液酸化糖型虽生物活性略有下降（57%），但免疫原性显著降低，为平衡疗效与安全性提供方案
四、总结与展望：O 糖基化研究的未来方向
相较于研究较为成熟的 N 糖基化，O 糖基化的功能仍有诸多未知：部分细胞因子（如 GM-CSF、干扰素 α）的 O 糖基化功能尚未完全明确，不同糖型对蛋白功能的调控机制仍需深入解析。但随着合成生物学、质谱分析等技术的发展，以下方向有望成为研究热点：
- 均一 O 糖型蛋白的高效制备：解决天然 O 糖基化异质性问题，明确特定糖型的功能
- 个性化糖工程：根据治疗需求设计定制化 O 糖型，平衡活性、半衰期与免疫原性
- 新型糖基化位点挖掘：通过 AI 预测与实验验证，为蛋白药物引入全新功能性 O 糖基化位点
O 糖基化作为蛋白药物的 "功能调节器"，其研究不仅加深了我们对蛋白修饰生物学的理解，更为下一代生物制药的研发提供了全新思路。未来，随着糖工程技术的不断突破，相信会有更多基于 O 糖基化优化的高效、安全的治疗蛋白走向临床。
